Un estudio realizado por investigadores de la Universidad Nacional de Jujuy (UNJu)-publicado en 2020 por la revista científica de la misma institución académica-, evaluó levaduras nativas aisladas de uvas de Purmamarca con el objetivo de determinar su potencial enológico, analizando su desempeño fermentativo y su impacto en las características sensoriales del vino. A continuación, reproducimos el texto completo del estudio.
Autores: Cristian Gonzalo Benitez* (E-mail: benitezcristiangonzalo@gmail.com), Amalia María Ortega, Macarena Peynado, José Torrejón y Alfredo Agüero, de la Facultad de Ciencias Agrarias de UNju.
El presente estudio tuvo como objetivo seleccionar y caracterizar levaduras nativas con potencial enológico de la localidad de Purmamarca, Jujuy. Se estudiaron levaduras aisladas, provenientes de uvas de distintas variedades, obtenidas por estudios previos. Se conformó una muestra con 20 levaduras, en las que se determinó su rendimiento en el proceso fermentativo, y su influencia sobre las características sensoriales del vino.
Las levaduras MP20, 21, 26 y 27, identificadas como Saccharomyces cerevisiae, presentaron un elevado poder fermentativo, resistencia al anhídrido sulfuroso, baja formación de espuma, sedimento, actividad β-glucosidasa y una baja producción de ácido acético. La levadura no-Saccharomyces MP3, identificada como Clavispora lusitaniae, también presentó características enológicas eficientes. Estas levaduras podrían ser un punto de partida para la producción de vinos que presenten características propias de la región, de manera rentable y sostenible, innovando con valor agregado en un mercado tan competitivo como el actual.
Introducción
La localidad de Purmamarca, en la provincia de Jujuy, Argentina, representa una región particular y por lo tanto única para el desarrollo de la industria vitivinícola, puesto que el clima, suelo, la uva, pureza del aire, altura, gran luminosidad y radiación de la región constituyen el potencial requerido en la producción de vinos de calidad diferenciada, los cuales resultan en productos con un alto grado de alcohol y una franca estabilidad en el aroma y color.
A pesar de que la práctica enológica con levaduras secas activas (LSA) comerciales se encuentra enraizada en las bodegas de la región, resultan viables las inoculaciones con levaduras autóctonas seleccionadas (Capece et al., 2010; Formento et al., 2011; Suranská, Vránová y Omelková, 2016). Estas pueden influir de forma decisiva en la obtención de vinos típicos con una calidad estandarizada (Tristezza et al., 2014; Capozzi, Garofalo, Chiriatti, Grieco y Spano, 2015), además de reflejar la biodiversidad propia de la zona donde se encuentran, formando parte del “terroir” (Bokulich, Thorngate, Richardson, Mills, 2014; Gilbert, van der Lelie, Zarraonaindia, 2014) de los vinos de Purmamarca.
Distintos autores (Suarez Lepe e Íñigo Leal, 2004; Pretorius, 2000; Regodon, 1997) afirman que las levaduras con características enológicas eficientes deben presentar un adecuado arranque y correcta cinética de fermentación, escasa producción de espuma, rápida formación de sedimento para la obtención de vinos límpidos e inexistencia de la formación de película/anillo. Resulta imprescindible su capacidad de producir y tolerar el etanol con el fin de garantizar la finalización del proceso fermentativo (Barrajón, Arévalo-Villena, Úbeda y Briones, 2011), que sea resistente al SO2, que contenga a la enzima β-glucosidasa para ejercer su actividad en la obtención de compuestos volátiles, que genere trazas de acidez volátil y cantidades mínimas de compuestos azufrados que pueden interferir en la expresión aromática del vino.
De las levaduras nativas aisladas de uvas en Purmamarca, se evaluaron características tecnológicas para determinar su eficiencia en el proceso de fermentación y características cualitativas para determinar su participación en las cualidades sensoriales de los vinos, con el objetivo de seleccionar las que presenten características enológicas eficientes.
Materiales y métodos
Procedencia de las cepas de levaduras
Las levaduras utilizadas para este trabajo fueron proporcionadas por la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agrarias – UNJu. En el año 2019, se desarrollaron investigaciones basadas en el aislamiento de levaduras vínicas, conseguidas a través de muestras de uva de diferentes viñedos situados en la localidad de Purmamarca, Jujuy, Argentina. Como resultado de estos trabajos se conformó una colección de 20 levaduras nativas de la zona, las cuales se encuentran bajo condiciones de mantenimiento.
Preparación de la colección de trabajo
De cada cepa se extrajo una alícuota del tubo de mantenimiento, se sembró en tubos con 2 mL del medio líquido YPD (extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubó en estufa durante 24 hs a 28±2ºC. La pureza de los cultivos se confirmó mediante observaciones microscópicas y macroscópicas. Los ensayos fueron realizados con levaduras en fase exponencial, en mosto pasteurizado (60°C durante 15 minutos), por duplicado.
Características tecnológicas
Tolerancia al etanol (Abad Arranz, 2006): Cada levadura se sembró en una serie de tres tubos con diferentes concentraciones de mosto alcoholizado (10-12-15% v/v). Luego se sellaron con tapón vas-par (vaselina-parafina 50%) y se incubaron en estufa a 28°C durante 7 días. El desplazamiento del tapón indica que la levadura fermentó y produjo CO2 resistiendo la concentración de etanol del medio.
Poder de fermentación (Abad Arranz, 2006): El poder fermentativo se calculó gravimétricamente con el peso inicial y el peso final de la fermentación de 30 mL de mosto. La pérdida de peso se registró diariamente para graficar las curvas de fermentación. PF (%v/v en etanol) = [P inicial (g) – P final (g) * 1,5].
Cinética de fermentación (Abad Arranz, 2006): Se construyó la curva de cinética tomando los datos inversos de pérdida de peso, producidos por la liberación de CO2 = [P final (g) – P inicial (g)].
Resistencia al anhídrido sulfuroso (Furlani et al., 2017): Cada levadura se sembró en una serie de tres tubos con mosto con diferentes concentraciones de anhídrido sulfuroso (50-100-300 ppm). Los tubos se sellaron con tapón de vas-par para poner en evidencia el crecimiento de la levadura.
Formación de espuma (Nikolaou, Soufleros, Bouloumpasi y Tzanetakis, 2004): Cada levadura se sembró en tubos con mosto. Se midió la altura máxima alcanzada por la espuma al cabo de 10 días y se clasificaron en tres categorías: F0 (menor a 2 milímetros), F1 (entre 2 y 4 milímetros) y F2 (mayor de 4 milímetros).
Formación de sustancias adherentes (Rainieri y Pretorius, 2000): Se observó la formación de película o anillo
Formación de sedimentos (Rainieri y Pretorius, 2000)Se observó la formación de sedimentos y de flóculos.
Los ensayos fueron realizados con levaduras en fase exponencial, en mosto pasteurizado (60°C durante 15 minutos), por duplicado.
Características cualitativas
Actividad β-glucosidasa (Hernández, Espinosa, Fernández-González y Briones, 2003): Se sembraron 5 µL de las levaduras en un medio de cultivo específico para evidenciar la actividad β-glucosidasa (Extracto de levadura 1%; peptona 2%, glucosa 2%; citrato de Hierro Amonio 0,02%; esculina 0,5%; agar 2%). La actividad se evidenció por la presencia de un halo negro que se forma alrededor de la colonia por la reacción entre la esculina hidrolizada, que se transforma en esculetina por la actividad enzimática de la β-glucosidasa, y la sal férrica soluble.
Formación de ácido a partir de glucosa (Kurtzman y Cayó, 1998): En cada placa de Petri se utilizó el medio específico para evidenciar la formación de ácido (Extracto de levadura 0,5%; glucosa 2%; carbonato de calcio 1%; agar 2,5%). Se sembraron 5 µL de las cepas. La producción de ácido a partir de glucosa se evidencia por la formación de un halo transparente alrededor de la colonia, debido a la disolución del carbonato de calcio, por la producción de ácido, la cual se cuantificó de la siguiente manera:
- a. ++++ halo de disolución mayor a 3 mm/alta formación de ácido
- b. +++ halo de disolución entre 2-3 mm/baja formación de ácido
- c. ++ halo de disolución mayor entre 1 y 2 mm/ leve formación de ácido
- d. + halo de disolución menor a 1 mm/trazas de ácido
Producción de ácido sulfhídrico (Nikolaou et al., 2004): Se sembró por estría en agar Biggy. El medio de cultivo tiene sulfito de bismuto, siendo el sulfito el principal precursor de la producción excesiva de SH2. Las colonias se desarrollan de color chocolate a beige, de intensidad proporcional a la producción del sulfuro. La intensidad de coloración en este medio es una indicación de la máxima actividad de la enzima sulfito reductasa de una cepa dada determinada genéticamente. A continuación, se observó la coloración y los resultados asociados:
- a. ++++ chocolate/alta formación de SH2
- b. +++ beige-marrón/media formación de SH2
- c. ++ beige/baja formación de SH2
- d. +/- beige claro/trazas de SH2
Identificación de las levaduras con características enológicas eficientes
La identificación de las cepas se realizó por Espectrometría de Masas en la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral. Las mismas se sembraron y procesaron bajo protocolos estandarizados de trabajos y se analizaron por MALDI-TOF-TOF para su final identificación por base de datos SARAMIS.
Análisis estadístico
Con el fin de agrupar las cepas según la semejanza de sus características tecnológicas, cualitativas y de diferenciación, para poder facilitar el análisis de los resultados, se realizó un análisis de conglomerados a través del Software InfoStat versión 2017 (Di Rienzo y otros, 2017).
Resultados y discusión
Análisis conglomerados
Se contruyó una matriz de similitud a partir de la cual se consiguió un dendrograma con una distancia de corte de 4,8, en el cual se constituyen 4 cluster. Ver gráfico 1.
Todas las levaduras pertenecientes al cluster Nº3 (MP8, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27), y una del cluster Nº4 (MP3) se destacaron al presentar características enológicas eficientes, útiles como potenciales cultivos iniciadores en un proceso de vinificación. Los resultados de los ensayos realizados a las levaduras se detallan en la Tabla 1 y su identificación de género y especie en la Tabla 2.
Las cepas MP20, 21, 26 y 27 fueron identificadas como S. cerevisiae. Produjeron un promedio de 10,47% v/v de alcohol, ver Gráficos 4 y 5. El límite mínimo establecido por OIV para vinos es de 8,5% v/v de alcohol. El porcentaje fue similar al reportado por Tufariello (2019), donde las levaduras estudiadas produjeron vinos con un promedio de 12,11% v/v de alcohol.
Las levaduras presentaron una cinética de fermentación correcta, liberando más de 6,5 g de CO2 al finalizar los 21 días de fermentación, si la levadura presenta una cinética de fermentación lenta, la fase de latencia será mayor en el inicio del proceso, posibilitando ataques bacterianos u oxidantes y la fermentación tendrá problemas de acabado, dando una terminación incompleta en la metabolización de los azúcares por parte de la cepa y un consumo innecesario de energía para la refrigeración; en una fermentación rápida habrá desprendimientos calóricos bruscos, con un aumento excesivo de la temperatura que ocasionará pérdidas aromáticas, disminución en la calidad del vino y suspensión fermentativa por muertes térmicas de las levaduras (Abad Arranz, 2006).
Presentaron la capacidad de tolerar la concentración más alta de alcohol probada, siendo proporcional a su capacidad de producirlo, este resultado tiene correlación con los encontrados en el trabajo de ĎurčansKá (2019), donde el 37% de las levaduras estudiadas toleraron el 20% v/v de alcohol.
Todas las levaduras toleraron 300 ppm de anhídrido, superando ampliamente los 50 ppm de SO2 total que se solicita resistir para ser adecuadas en la vinificación (OIV-OENO 370, 2012). El SO2 es un agente antiséptico y antioxidante, naturalmente empleado en enología con el fin de conseguir la estabilidad microbiológica y caracterización de levaduras fermentativas. Cantidades moderadas de dicho agente (30 a 100 ppm), destruyen la mayoría de las especies débilmente fermentativas y muchas de las perjudiciales para la vinificación, mientras que concentraciones superiores a 200 ppm retrasan el inicio fermentativo y pueden inclusive conseguir inhibirlo (Zambonelli, 1998).
También se registró una baja producción de espuma, menor a 2 mm (F0), y sedimentos, mientras menos espuma se produzca, quedarán menos espacios de cabeza y el porcentaje de volumen utilizable será mayor (Valade, 2004). La sedimentación favorece la clarificación del vino y limpieza de las piletas de fermentación. Por otro lado, la presencia de película o anillo serían un indicio de la presencia de levaduras oxidativas no-Saccharomyces que pueden enturbiar, formar velos en los vinos o adherirse a las paredes de los fermentadores (García-Junco, 2001; Torija Martinez y María Jesús, 2002; Mas et al., 2006).
Las levaduras presentaron actividad β-glucosidasa, acorde a lo informado por ĎurčansKá (2019) donde todas las cepas utilizaron la enzima con diámetros variables de halo. Formaron trazas de ácido acético en las placas y una moderada concentración de ácido sulfhídrico.
En el trabajo de Aponte (2016) la mayoría de las levaduras también produjeron una considerable cantidad de SH2, mientras que en Capozzi (2019) y Tufariello (2019) más de la mitad de las cepas no formaron dicho ácido. El ácido acético es el principal ácido volátil del vino y es generado siempre en una fermentación alcohólica por la levadura. Tiene un aporte organoléptico negativo y por lo tanto no deseado, con una concentración permitida por la OIV, expresado ácido acético, 0,2 a 0,6 g/L. Tampoco se espera una elevada producción de ácido sulfhídrico y compuestos azufrados, puesto que los mismos generan olor a huevo podrido, cebolla podrida, plásticos o a neumáticos en los vinos (Esteve-Zarzoso, Gostincar, Bobet, Uruburu y Querol, 2000; Torija Martinez y María Jesús, 2002; Suarez Lepe e Íñigo Leal, 2004; Morata y otros, 2005; Mas et al., 2006; Abad Arranz, 2006; Swiegers y Pretorius, 2007).
En las no-Saccharomyces destacadas están las cepas MP8 y 24 identificadas como Candida krusei, y la cepa MP3 como Clavispora lusitaniae. A la fecha, no existen trabajos que detallen la utilización de C. krusei en enología (se la considera un agente contaminante), mientras que en el caso de C. lusitaniae, Gutierrez Contreras y otros en Colombia (2011) la evaluaron en la fermentación alcohólica de jugo de fique, observando que en este medio la levadura produjo 33,81 g/L de etanol, un 43,25% más de lo producido por S. cerevisiae.
El promedio de su poder fermentativo fue de 7,43% v/v de alcohol, próximo al 8,04% v/v de alcohol producido por las levaduras en el trabajo de Franco (2019). Toleraron elevadas concentraciones de etanol y anhídrido sulfuroso. El alcohol, junto con otros productos, es producido por las levaduras no-Saccharomyces en la primera etapa de la fermentación alcohólica de los carbohidratos presentes en el mosto, los cuales contribuyen a la composición química y a la calidad sensorial del vino (Lambrechts y Pretorius, 2000).
Su población se ve notoriamente reducida después de los primeros dos o tres días de la fermentación alcohólica por la vulnerabilidad que posee a la concentración de alcohol (5 a 6% v/v en la mayoría de las especies) que hay en esa etapa, siendo afectada la estructura de su membrana citoplasmática y sufriendo la pérdida de la actividad de ciertas enzimas de la glucólisis (Ricci et al., 2004). Generaron poca espuma, mucho sedimento, la MP24 produjo sustancias adherentes.
Las levaduras mostraron una débil producción de ácido acético y actividad β-glucosidasa. Respondieron notablemente a la actividad enzimática, considerando que los valores de pH del mosto de la uva y del vino se encuentran alrededor del 2,8 al 3,5, disminuyendo dicha actividad en un 33% (Hernández et al., 2003). Comitini (2011) registró en la mayoría de las cepas una elevada producción de ácido sulfhídrico pero sólo el 30% presentó la enzima β-glucosidasa. Con dicha enzima, las cepas no-Saccharomyces poseen un papel sobre el aroma de los vinos, que puede ser más destacado que el de las Saccharomyces (Erten, 2002), al poder catalizar la hidrolización de ciertos compuestos glicosídicos, obteniéndose aquellos que pueden modificar el perfil aromático en el vino (Arévalo, Úbeda, Cordero y Briones, 2005).
Tanto la enzima como los productos de su actividad reciben un lugar de análisis específico en el trabajo realizado en España por Arévalo Villena (2005), determinándose que la levadura Debaryomyces pseudopolymorphus es la que posee una adecuada actividad β-glucosidasa, capaz de hidrolizar los precursores del aroma de distintas variedades de uva por la adición directa de los extractos parcialmente purificados, liofilizados o inmovilizados, poniéndose de manifiesto la diferencia entre los vinos tratados con dicha actividad y el vino control.
Conclusiones
El presente trabajo aportó datos relevantes en cuanto a las características tecnológicas y cualitativas presentes en las levaduras nativas aisladas de uvas de Purmamarca.
Las levaduras con el código MP20, 21, 26 y 27, identificadas como S. cerevisiae, y la MP3, identificada como C. lusitaniae, presentaron características tecnológicas favorables, capacidad para producir alcohol en un tiempo adecuado y una gran resistencia al alcohol y anhídrido sulfuroso. Así también, en las características cualitativas tuvieron un balance positivo, presentan actividad de β-glucosidasa y baja producción de ácido acético.
Estas levaduras podrían ser utilizadas por los bodegueros locales en fermentaciones mixtas a pequeña escala, dando el puntapié inicial y apostando por las levaduras de la zona, con lo que se podría lograr vinos con valor agregado, lo que se traduce en un producto competitivo, rentable y sostenible.
Cabe destacar que este trabajo de investigación es pionero, pudiendo ser un soporte en la ampliación de estudios posteriores.
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